Мікроскопічне фарбування

Пофарбований гістологічний зразок на предметному шкельці мікроскопа

Розчин флуоресцеїну, освітлений синім світлом

Мікроскопічне фарбування — техніка, яка використовується для посилення контрасту зразків, як правило, вирізнення елементів на мікроскопічному рівні. Фарби та барвники часто використовуються в гістології (мікроскопічне дослідження біологічних тканин), цитології (мікроскопічне дослідження клітин), а також у алопатичних галузях гістопатології, гематології та цитопатології, які зосереджені на вивченні та діагностиці захворювань на мікроскопічному рівні. Плями можна використовувати для визначення біологічних тканин (наприклад, виділення м'язових волокон або сполучних тканин), популяції клітин (класифікація різних клітин крові ) або органели в окремих клітинах.

У біохімії це включає в себе додавання специфічного для класу (ДНК, білки, ліпіди, вуглеводи) барвника до субстрату для кваліфікації або кількісного визначення присутності певної сполуки. Фарбування та флуоресцентне мічення можуть служити для аналогічних цілей. Біологічне фарбування також використовується для позначення клітин у проточній цитометрії та для позначення білків нуклеїнових кислот у гель-електрофорезі. Світлові мікроскопи використовуються для перегляду пофарбованих зразків при великому збільшенні, зазвичай з використанням світлого поля або епіфлуоресцентного освітлення. Фарбування не обмежується лише біологічними матеріалами, оскільки його можна використовувати і для вивчення структури інших матеріалів. Наприклад, пластинчасті структури напівкристалічних полімерів або доменні структури блок-сополімерів.

Фарбування in vivo, in vitro, ex vivo

• Фарбування in vivo (також називається прижиттєвим фарбуванням) — фарбування живих тканин у цілісному живому організмі. Завдяки тому, що певні клітини або структури набувають контрастних кольорів, їхню форму (морфологію) або положення всередині клітини чи тканини можна легко побачити та вивчити. Зазвичай метою є виявлення цитологічних деталей, які інакше могли б бути неочевидними. Однак фарбування також може виявити, де в клітинах або тканинах відбуваються певні хімічні процеси або специфічні хімічні реакції.
• Фарбування in vitro — фарбування клітин або структур, які були вилучені з їхнього біологічного контексту. Певні плями часто комбінують, щоб показати більше деталей і особливостей, ніж одна пляма окремо. У поєднанні зі спеціальними протоколами для фіксації та підготовки зразків науковці та лікарі можуть використовувати ці стандартні методи як послідовні, повторювані діагностичні інструменти. Контрфарба — пляма, яка робить клітини або структури більш видимими, якщо вони не повністю видимі з основною плямою.
• Фарбування ex vivo. Багато клітин продовжують жити і метаболізувати, поки вони не будуть «закріплені».

Ядра забарвлені синім за допомогою DAPI, мікротрубки антитіл позначені зеленим кольором, нитки актину на червоно зафарбовані фалоїдином

Кристалічний фіолетовий забарвлює як грампозитивні, так і грамнегативні організми. Обробка спиртом позбавляє кристалічно-фіолетового кольору лише грамнегативні мікроорганізми. Сафранін як контрбарвник використовується для забарвлення грамнегативних організмів, знебарвлених спиртом. Деякі методи фарбування засновані на цій властивості. Ті плями, які виключаються живими клітинами, але поглинаються вже мертвими клітинами, називаються життєво важливими плямами (наприклад, трипановий синій або пропідій йодид для еукаріотичних клітин). Ті, які проникають у живі клітини та забарвлюють їх, називаються суправітальними плямами (наприклад, новий метиленовий синій і блискучий крезиловий синій), для ретикулоцитів). Однак ці плями з часом стають токсичними для організму, деякі більше, ніж інші. Частково через їх токсичну взаємодію всередині живої клітини, коли суправітальні плями потрапляють у живу клітину, вони можуть створити характерний малюнок фарбування, відмінний від фарбування вже фіксованої клітини (наприклад, «ретикулоцитарний» вигляд проти дифузної «поліхромазії»). Для досягнення бажаного ефекту фарби використовуються в дуже розбавлених розчинах від 1 : 5000 до 1 : 500000. Слід відзначити, що багато барвників можна використовувати як у живих, так і в фіксованих клітинах.

Підготування

залежать від типу запланованого аналізу. Можуть знадобитися деякі або всі наведені нижче процедури .

• Мокре кріплення використовується для перегляду живих організмів і може бути виготовлене за допомогою води. Рідина додається на предметне шкло перед додаванням мікроорганізмів, а на зразок у воді та фарбуванні поміщається покривне шкельце, щоб утримувати його в полі зору .
• Фіксація, яка сама по собі може складатися з кількох етапів, спрямована на збереження форми клітин або тканини, наскільки це можливо. Іноді теплова фіксація використовується, щоб знищити, приклеїти та змінити зразок, щоб він приймав плями. Більшість хімічних фіксаторів (хімічних речовин, що спричиняють фіксацію) створюють хімічні зв'язки між білками та іншими речовинами у зразку, підвищуючи їхню жорсткість. Звичайні фіксатори включають формальдегід, етанол, метанол та/або пікринову кислоту. Шматочки тканини можна залити в парафін, щоб підвищити їхню механічну міцність і стабільність і полегшити нарізання на тонкі скибочки.
• Морилки — це хімічні речовини, які мають здатність створювати барвники для фарбування матеріалів, які інакше не залишаються плямами.

Морилки поділяються на дві категорії: a) основна протрава, яка реагує з кислотними барвниками, наприклад галуном, сульфатом заліза, хлоридом цетилпіридинію тощо; б) кислотна протравка, яка реагує з основними барвниками, наприклад пікриновою кислотою, дубильною кислотою тощо.

• Пряме фарбування: виконується без протрави.
• Непряме фарбування: фарбування за допомогою протрави.

У таблиці наведені методи непрямого фарбування та протрави

• Пермеабілізація передбачає обробку клітин зазвичай м’якою поверхневоактивною речовиною. Ця обробка розчиняє клітинні мембрани та пропускає більші молекули барвника всередину клітини.
• Монтаж зазвичай передбачає прикріплення зразків до предметного шкла мікроскопа для спостереження та аналізу. У деяких випадках клітини можна вирощувати безпосередньо на предметному шклі. Для зразків пухких клітин, як Пап-тест, зразок можна нанести безпосередньо на предметне шкло. Для більших шматків тканини роблять тонкі зрізи за допомогою мікротому.

Якість барвників

Більшість барвників, які зазвичай використовуються в мікроскопії, мають бути перевірені незалежним контролюючим органом, мусять відповідати певним стандартам чистоти, вмісту барвника та продуктивности в техніках фарбування, що забезпечуватиме правильніші експерименти та більшу надійність .

Негативне фарбування

Зразок негативного барвіння

простий метод фарбування бактерій, який зазвичай успішний, навіть якщо позитивні методи фарбування не дають результату, полягає у нанесенні зразка на предметне скло і використанні нігрозину (чорний синтетичний барвник) або туші (водна суспензія частинок вуглецю). Після висихання мікроорганізми можна розглядати під мікроскопом у світлому полі як більш світлі включення, добре контрастні з темним середовищем, що їх оточує. Негативне фарбування може забарвити фон замість організмів, оскільки клітинна стінка мікроорганізмів зазвичай має негативний заряд, який відштовхує негативно заряджену пляму. Барвники, що використовуються в негативному фарбуванні, кислотні. Примітка: негативне фарбування є м'якою технікою, яка не може знищити мікроорганізми, а тому непридатна для вивчення патогенів.

Позитивне фарбування

використовує основні барвники для фарбування зразка на яскравому тлі. Хоча хромофор використовується як для негативного, так і для позитивного фарбування, типом хромофора, що використовується в цій техніці, є позитивно заряджений іон, а не негативний. Негативно заряджена клітинна стінка багатьох мікроорганізмів притягує позитивно заряджений хромофор, який змушує зразок поглинати пляму, надаючи їй колір використовуваної мітки. У мікробіології позитивне фарбування використовується частіше, ніж негативне. Нижче наведені різні типи позитивного фарбування. 

Просте фарбування

техніка, яка одночасно використовує лише один тип плями на предметному склі. Оскільки використовується лише одна пляма, зразки (для позитивних плям) або фон (для негативних плям) будуть одного кольору. Тому прості плями зазвичай використовуються для перегляду лише одного організму на слайді. Диференційне фарбування використовує кілька плям на слайді. Залежно від використовуваних плям, організми з різними властивостями матимуть різні кольори, що дозволяє класифікувати кілька зразків. Диференціальне фарбування також можна використовувати для фарбування різних органел в межах одного організму, що можна побачити під час фарбування ендоспор.

Способи барвіння

Фарбування за Грамом використовується для визначення статусу за Грамом для загальної класифікації бактерій на основі складу їхньої клітинної стінки. Використовується кристалічний фіолетовий для фарбування клітинних стінок, йод (як протраву) і  бфуксин]] або сафранін (позначення всіх бактерій). Статус за Грамом допомагає розділити зразки бактерій на дві групи, які, як правило, репрезентують їхню філогенію. Ця характеристика в поєднанні з іншими методами робить його корисним інструментом у клінічних мікробіологічних лабораторіях, де він може бути важливим у ранньому виборі відповідних антибіотиків . На більшості препаратів, забарвлених за Грамом, грамнегативні мікроорганізми виглядають червоними або рожевими через контрфарбування. Через наявність більш високого вмісту ліпідів після обробки спиртом пористість клітинної стінки збільшується, отже, комплекс CVI (кристалічний фіолетовий – йод) може проходити. Таким чином, первинна пляма не зберігається. Крім того, на відміну від більшості грампозитивних бактерій, грамнегативні бактерії мають лише кілька шарів пептидоглікану та вторинну клітинну мембрану, яка складається переважно з ліпополісахариду .

Фарбування ендоспор використовується для визначення наявности або відсутности ендоспор. Спори бактерій важко пофарбувати, оскільки вони не вбирають водні барвні реагенти. Фарбування ендоспор потрібне для ідентифікації бактеріальних патогенів, що утворюють ендоспори, таких як Clostridium difficile. До розробки більш ефективних методів це фарбування виконувалося за методом Вірца з термофіксацією та контрфарбуванням. Завдяки використанню малахітового зеленого та розбавленого співвідношення карбол-фуксину фіксація бактерій в осмієвій кислоті була чудовим способом уникнути змішування барвників. Зараз карболфуксин замінюють водним сафраніном у поєднанні з 5% формулою малахітового зеленого. Ця нова та вдосконалена композиція мічення була виконана з використанням термофіксації, промивання та промокання для подальшого дослідження. Після дослідження всі бактерії, що утворюють ендоспори, забарвлюються в зелений колір, а всі інші клітини будуть червоними..

Забарвлювання Ціля–Нільсена

Барвник — кислотостійкий, використовується для фарбування видів Mycobacterium tuberculosis, які не фарбуються за допомогою стандартних лабораторних процедур фарбування, таких як фарбування за Грамом. Виконується за допомогою карболового фуксину червоного кольору, який забарвлює бактерії, і контрфарбувальника, такого як метиленовий синій.

Мікроскопічний вид гістологічного зразка легеневої тканини людини, пофарбованої гематоксиліном і еозином

Фарбування гематоксиліном-еозином часто використовується в гістології для дослідження тонких зрізів тканини. Гематоксилін забарвлює клітинні ядра в синій колір, тоді як еозин забарвлює цитоплазму, сполучну тканину та інші позаклітинні речовини в рожевий або червоний кольори . Еозин сильно поглинається еритроцитами, забарвлюючи їх у яскраво-червоний колір. У майстерно виготовленому препараті H&E червоні кров'яні тільця майже помаранчеві, а колаген і цитоплазма (особливо м'язи) набувають різних відтінків рожевого.

Фарбування за Папаніколау, або PAP-фарбування, було розроблено для заміни тонкоголкової аспіраційної цитології (FNAC) у надії скоротити час фарбування та вартість без шкоди для якості. Це фарбування є часто використовуваним методом для дослідження зразків клітин різних типів тканин у різних органах. PAP-фарбування зазнало кількох модифікацій, щоб стати «відповідною альтернативою» для FNAC. Цей перехід став результатом оцінки вченими мокрих фіксованих мазків, що зберігають структуру ядер на відміну від непрозорого вигляду висушених на повітрі мазків Романовського. Це призвело до створення гібридної фарби вологої фіксації та сушіння на повітрі, відомої як ультрашвидка фарба папаніколау. Ця модифікація включає використання назального фізіологічного розчину для регідратації клітин для підвищення прозорости клітин і в поєднанні з використанням спиртового формаліну для посилення кольору ядер. Фарба за Папаніколау тепер використовується замість цитологічного фарбування у всіх типах органів завдяки її покращенню морфологічної якости, скороченню часу фарбування та зниженню вартости. Його часто використовують для фарбування мазка Папаніколау. У ньому використовується комбінація гематоксиліну, оранжевого G, еозину Y, світло-зеленого SF жовтуватого кольору та іноді Бісмарка Брауна Y .

Барвіння PAS виявляє грибок Histoplasma

Періодична кислота-Шифф (PAS) — гістологічна спеціальна фарба, яка використовується для позначення вуглеводів (глікогену, глікопротеїну, протеогліканів). Зазвичай використовується на тканинах печінки, щоб розрізнити різні типи захворювань через накопичення глікогену. Може виявити гранули глікогену в пухлинах яєчників, залозах ендокринної системи, а також у сечовому міхурі та нирках. Базальні мембрани також можуть виявлятися при фарбуванні PAS і можуть бути важливими при діагностиці захворювання нирок. Завдяки великому об’єму вуглеводів у клітинній стінці гіф та дріжджових форм грибів фарбування періодною кислотою за Шиффом може допомогти знайти ці види в зразках тканин людського тіла.

Трихром Массона - триколірне фарбування на основі оригінальної техніки Массона для різних конкретних застосувань, але всі вони добре підходять для вирізнення клітин від навколишньої сполучної тканини. 

Фарбування за Романовським вважається ефектом поліхромного фарбування і базується на поєднанні еозину і деметильованого метиленового синього. Ця фарба створює різні кольори для всіх клітинних структур («ефект Романовського-Гімзи»), тому її використовували для фарбування поліморфів нейтрофілів і клітинних ядер. Поширені варіанти включають мічення Райта, Дженнера, Мея-Грюнвальда, Лейшмана та мічення Гімзи. Усі вони використовуються для дослідження зразків крові або кісткового мозку. Їм надають перевагу над H&E для перевірки клітин крові, оскільки різні типи лейкоцитів (білих кров’яних тілець) можна легко розрізнити. Усі вони також підходять для дослідження крови на виявлення кров’яних паразитів, таких як малярія .

Мічення метенаміну сріблом вирізняє гістоплазму(ілюстровано чорним)

Фарбування сріблом— використання срібла для барвіння гістологічних зрізів. Цей вид фарбування важливий для демонстрації білків, наприклад, колагену III типу, і ДНК. Він використовується, щоб показати як речовини всередині, так і поза клітинами. Фарбування сріблом також використовується при гель-електрофорезі. Аргентофінові клітини відновлюють розчин срібла до металевого срібла після фіксації формаліном. Цей метод був відкритий італійцем Камілло Ґольджі, використовуючи реакцію між нітратом срібла та дихроматом калію, що призвело до осадження хромату срібла в деяких клітинах. Гірофільні клітини відновлюють розчин срібла до металевого срібла після дії фарби, яка містить відновник. Прикладом цього може бути гідрохінон або формалін.

Фарбування судановими барвниками — синтетичними органічними сполуками, які використовуються як барвники для різних пластмас (пластикові барвники), а також для фарбування суданофільних біологічних зразків, зазвичай ліпідів. Судан III, Судан IV, тетраоксид осмію та Судан Black B часто використовуються для визначення рівня жиру в калі при діагностиці стеатореї.

Фарбування за Віртцом-Конкліном — спеціальна техніка, призначена для фарбування справжніх ендоспор із використанням фарби малахітового зеленого як основної фарби та сафраніну як контрфарби. Після фарбування вони не знебарвлюються. Нагрівання під час фарбування є фактором, що пришвидшує реакцію . Тепло допомагає відкрити мембрану спори, барвник легше проникає. Основне призначення цього фарбування - показати проростання спор бактерій. Якщо відбувається процес проростання, то спора забарвлюється в зелений колір за рахунок малахітової зелені, а навколишня клітина буде червона від сафраніну. Це мічення також може допомогти визначити орієнтацію спори в бактеріальній клітині, чи є вона кінцевою (на кінчику), субтермінальною (всередині клітини) або центральною (повністю в середині клітини).

Фарбування гібридизуючим пептидом колагену (CHP) дозволяє легко фарбувати денатуровані колагени будь-якого типу (типу I, II, IV тощо), незалежно від того, чи були вони пошкоджені чи деградовані через дію ферментативних, механічних, хімічних чи термічних засобів. Вони працюють шляхом повторного згортання в потрійну спіраль колагену з наявними одиночними нитками в тканині. Метод можна візуалізувати за допомогою простого флуоресцентного мікроскопа.

Література

• Penney DP, Powers JM, Frank M, Willis C, Churukian C (2002). «Analysis and testing of biological stains--the Biological Stain Commission Procedures». Biotechnic & Histochemistry. 77 (5–6): 237–75. doi:10.1080/714028210. PMID 12564600.
• Horobin R, Kiernan J, eds. (2002). Conn's Biological Stains: A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine. Taylor & Francis. ISBN 978-1-85996-099-8.
• Clark G (1981). Staining Procedures (4th ed.). Baltimore: Williams & Wilkins. p. 412. ISBN 978-0-683-01707-6.
• Gill GW (2013). «Papanicolaou Stain». Cytopreparation. Essentials in Cytopathology. Vol. 12. pp. 143—189. doi:10.1007/978-1-4614-4933-1_10. ISBN 978-1-4614-4932-4. ISSN 1574-9053.
• «Periodic Acid-Schiff (PAS): Diagnostic Applications — LabCE.com, Laboratory Continuing Education». labce.com. Retrieved 2020-04-16.
• Corey L (March 1986). «Laboratory diagnosis of herpes simplex virus infections. Principles guiding the development of rapid diagnostic tests». Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 4 (3 Suppl): 111S–119S. doi:10.1016/s0732-8893(86)80049-9. PMID 3009082.
• Wells J (1988). «A Technique for Staining the Superficial Cells of Plucked Hair Follicles and Other Solid Tissues». Stain Technology. 63 (3).
• Tomov N, Dimitrov N (2017). «Modified bismarck brown staining for demonstration of soft tissue mast cells» (PDF). Trakia Journal of Sciences. 15 (3): 195—197. doi:10.15547/tjs.2017.03.001.
• Levenfus I (2011). An efficient method for counting DAPI-stained cells using Fiji. Munich: Grin. ISBN 978-3-640-86284-9.
• Sellors JW, Sankaranarayanan R (eds.). «Chapter 4: An introduction to colposcopy: indications for colposcopy, instrumentation, principles and documentation of results». Colposcopy and treatment of cervical intraepithelial neoplasia: a beginners' manual. The World Health Organization. Archived from the original on 31 January 2019.
• Prieto D, Aparicio G, Morande PE, Zolessi FR (September 2014). «A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green». Histochemistry and Cell Biology. 142 (3): 335–45. doi:10.1007/s00418-014-1215-0. PMID 24671497. S2CID 11094194.
• Berlyn GP, Miksche JP (1976). Botanical Microtechnique and Cytochemistry. Iowa State University Press.
• Baker JR (1958). Principles of Biological Microtechnique. pp. 329 ff. London: Methuen.
• Kiernan JA (2001). «Classification and naming of dyes, stains and fluorochromes». Biotechnic & Histochemistry. 76 (5–6): 261–78. doi:10.1080/bih.76.5-6.261.278. PMID 11871748. S2CID 32479873.
• thefreedictionary.com > amphophilic Citing: Saunders Comprehensive Veterinary Dictionary, 3 ed. 2007 Elsevier, Inc
• «Negative Staining | Central Microscopy Research Facility». cmrf.research.uiowa.edu. Retrieved 2020-04-16.
• Bancroft JD, Gamble M, ред. (2002). Theory and Practice of Histological Techniques (вид. 5th). London: Churchill-Livingstone. ISBN 978-0-443-06435-7. 
• Kiernan JA (2015). Histological and Histochemical Methods. Theory and Practice. Banbury, UK: Scion. ISBN 978-1-907904-32-5. 
• Presnell JK, Schreibman MP (1997). Humason's Animal tissue Techniques (вид. 5th). Baltimore: Johns Hopkins University Press. 
• Ruzin SE (1999). Plant Microtechnique and Microscopy. New York: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-508956-1. 

Посилання

• The Biological Stain commission is an independent non-profit company that has been testing dyes since the early 1920s and issuing Certificates of approval for batches of dyes that meet internationally recognized standards.