| EcoRI | |
|---|---|
| |
| Ідентифікатори | |
| Символ | EcoRI |
| Інші ідентифікатори | Pfam: |
| Інша інформація | |
EcoRI (читається «еко ер один») — ензим, ендонуклеаза рестрикції, виділена з бактерії E. coli, є частиною рестрикційно-модифікаційної системи бактерії.
У практичній молекулярній біології EcoRI використовується як рестриктаза. EcoRI розрізає дволанцюгову ДНК створюючи 4-нуклеотидний липкий кінець з виступаючим 5'-фрагментом AATT. ДНК-фрагментом, по якому відбувається розрізання, є шестинуклеотидний фрагмент GAATTC/CTTAAG.
Структура
Первинна структура
EcoRI містить амінокислотний мотив PD..D/EXK, який знайдений в активному сайті багатьох рестриктаз.
Третинна та четвертинна структура
Ензим утворює гомодимер з двох 31-кДа одиниць, кожна з яких є одним поліпептидним ланцюгом та існує у вигляді глобули з α/β архітектурою. Кожна одиниця в димері містить мотив-«петлю», яка виступає з глобули та зв'язується з ДНК-мішенню при розпізнаванні.
EcoRI була закристалізована із ДНК-послідовністю, яку вона зазвичай розпізнає та розрізає (PDB код 1QPS). Аналіз кристалічної структури показав, що одиниці гомодимеру взаємодіють з ДНК симетричним чином. Дві α-спіралі від кожної одиниці сходяться в просторі утворюючи специфічний «затискач». На спіралях амінокислотні залишки Glu144 та Arg145 взаємодіють між собою, що ймовірно обумовлює фізичну комунікацію між активними сайтами обох одиниць.
Мішень
EcoRI розрізає ДНК по паліндромному сайту GAATTC/CTTAAG із утворенням липких кінців. EcoRI є високоспецифічним ензимом, тобто навіть одинична заміна/перестановка нуклеотидів в сайті розпізнавання призводить до сильного зниження афінності рестриктази до цього сайту і як наслідок до втрати здатності розпізнавати і розрізати його. Бактерії використовують цю властивість для захисту власної ДНК від дії рестриктази: другий аденозин в послідовностях GAATTC в бактеріальному геномі є метильованим, внаслідок чого власна ДНК бактерії є стабільною в присутності рестриктази.
Важливим фактором що обумовлює високу селективність рестриктази EcoRI до свого сайту розпізнавання є конформаційна жорсткість тривимірної структури білка. Внаслідок цього білок не може компенсувати збільшення енергії зв’язування через втрату багатьох водневих зв’язків конформаційною перебудовою для пошуків нових контактів у випадку неоптимальної послідовності ДНК.
Застосування
Рестриктази, такі як EcoRI, широко використовуються в молекулярній біології та генетиці, в таких експериментальних процедурах, як, наприклад, молекулярне клонування. Рестриктази (в тому числі EcoRI) генерують липкі кінці, які можна потім сполучити за допомогою ДНК-лігаз. EcoRI може давати неспецифічні продукти рестрикції (star-активність), залежно від умов реакції, таких як низька іонна сила розчину, високий вміст гліцерину, надлишок ензиму, високі значення pH та наявність певних органічних розчинників.